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DENGUE ELISA IgM

El dengue es una enfermedad febril aguda caracterizada por fiebre de 5-7 días de evolución, cefalea intensa, dolor retro orbital, muscular y articular y salpullido eritematoso. La forma clínica más severa es el llamado dengue hemorrágico. El agente etiológico pertenece a los flavivirus habiendo cuatro tipos inmunológicos 1, 2, 3 y 4. Se transmite por la picadura de mosquitos infectados como Aedes aegypti, Aedes albopictus y Aedes scutellaris. El período de incubación es de 3-15 días y no se transmite de persona a persona. La prueba utiliza una mezcla de los cuatro serotipos de antígenos de dengue obtenidos del cultivo celular. La detección del antígeno se hace por la glicoproteína NS1 que es común a todo los serotipos del dengue y se la puede utilizar para detectar infecciones primarias o secundarias en las primeras etapas de la infección.

CONDICIONES DE LA MUESTRA REQUERIDA

Los sueros/plasmas deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8°C si se van a procesar dentro de los 7 días siguientes a la toma , pero si el procesamiento se va a prolongar deben
congelarse a -20°C. No utilizar muestras lipémicas, hemolizadas o contaminadas.

METODOLOGÍA

Microelisa

PROCEDIMIENTO

a. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:
Es necesario preparar con antelación a la realización de la prueba la solución de lavado. Para ello completar hasta 1 litro con agua destilada un vial de 50 ml de solución de lavado concentrada. Si aparecen cristales durante la conservación de la solución concentrada, calentar a 37°C antes de diluirlo. Una vez preparada conservar entre 2 y 8°C.


El complejo antígeno-conjugado debe ser preparado al menos una hora antes de ser usado. Añadir 3 ml de solución de conjugado a un vial de antígeno liofilizado, dejar durante un minuto para permitir rehidratación y mezclar vigorosamente mediante vortex. El complejo antígeno-conjugado reconstituido puede ser usado durante 2 meses si es almacenado entre 2 y 8°C.
b. ENSAYO:
• Sacar todos los reactivos 1 hora antes de la realización del test para alcanzar la T° ambiente.
• Agitar todos los reactivos.
• Sacar el número de pocillos necesarios.
• Realizar en tubos aparte una dilución 1/20 de los sueros, para ello poner 5ul de suero en 95 ul de diluyente de muestras.
• Añadir 80 ul de diluyente de muestras a todos los pocillos que se vayan a emplear, excepto a los controles. Añadir 20ul de las diluciones 1/20 de las muestras, 100 ul de control positivo, 100 ul de control negativo y 100 ul del suero cut off (en duplicado) en los pocillos correspondientes.
•  Tapar mediante lámina adhesiva e incubar durante 60 minutos a 37°+- 1°C.
• Preparar el complejo antígeno-conjugado.
• Retirar la lamina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos 5 veces con 0.3 ml de solución de lavado, asegurándose que no queden restos de solución de lavado.
• Añadir inmediatamente 100 ul del complejo antígeno-conjugado reconstituido a todos los pocillos.
• Tapar mediante lamina adhesiva e incubar durante 60 minutos a 37°+- 1°C
• Retirar la lamina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos 5 veces con 0.3 ml de solución de lavado, asegurándose de que no queden restos de la solución de lavado.
•Añadir inmediatamente 100ul de solución de sustrato a todos los pocillos.
• Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
• Añadir inmediatamente 50 ul de solución de parada a todos los pocillos.
• Valorar espectrofotométricamente a 450/620 nm, antes de 1 hora de acabado el ensayo.
• Leer la placa en el equipo MINDRAY MR-96A, prender equipo, Ejecutar, Nuevo, Dengue abs, OK, muestra (colocar numero de muestras y controles), colocar placa en compartimento de lectura e Iniciar, una vez realizada la lectura imprimir los resultados.

c. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN:
Las densidades ópticas (D.O.) de los controles deben estar en los siguientes rangos, en caso contrario se desechara la prueba.
CONTROL POSITIVO D.O. >0.9
CONTROL NEGATIVO D.O. <0.5
CONTROL CUT OFF >0.55 Y <1.5

UTILIDAD DIAGNOSTICA DE LA PRUEBA

Detección de anticuerpos IgM al virus del Dengue.
Debido al incremento relativamente tardío de los niveles de anticuerpos hasta una concentración que pueda ser detectada diagnósticamente, un resultado negativo de un test de detección de anticuerpos temprano en el curso de la enfermedad no es definitivo. Las muestras deberían ser recogidas al menos 7
días tras el comienzo de los síntomas para excluir la posibilidad de una infección aguda por virus del dengue.

MATERIALES Y REACTIVOS

Todos los reactivos a excepción de la solución de lavado y el antígeno vienen listos para su uso.
1. VIRCELL IgM CAPTURE PLACA: Con 96 pocillos
2. VIRCELL SERUM DILUYENTE: 25 ml de diluyente para sueros
3. VIRCELL IgM CONTROL POSITIVO: 1.5 ml

VALORES DE REFERENCIA

Índice
Negativo: Menor de 9
Zona gris: 9 – 11
Positivo: Mayor de 11
• Las muestras dudosas deben ser vueltas a analizar y/o solicitar una nueva muestra para confirmación de resultados.
• Las muestras con índices inferiores a 9 se considera que no tienen anticuerpos específicos frente a dengue de tipo IgM.
• Las muestras con índices superiores a 11 se considera que tienen anticuerpos específicos frente a dengue de tipo IgM.